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      北京高中生物:PCR技術(shù)應(yīng)用之一---基因定點(diǎn)突變的原理

      PCR技術(shù)是一項(xiàng)很強(qiáng)大的技術(shù)手段,當(dāng)然也是考試的重點(diǎn)了。今天重點(diǎn)說一下PCR技術(shù)應(yīng)用之一:OverlapPCR技術(shù)---基因定點(diǎn)突變

      1. 基因定點(diǎn)突變:將某基因中的一個(gè)或者幾個(gè)堿基替換(補(bǔ)充說明也可以增加或者缺失堿基對)成其它堿基,導(dǎo)致基因中的部分堿基序列發(fā)生改變(也就是我們說的遺傳信息發(fā)生改變),實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)突變。

      2. 回顧一下強(qiáng)大的PCR技術(shù)原理:

       



      結(jié)論:

       通過上圖可以發(fā)現(xiàn),只要設(shè)計(jì)出DNA上某一段片段(本圖也就是藍(lán)色的目的基因片段)兩側(cè)的一對方向相反的引物,那么這一對引物,所夾的那段(本圖就是目的基因)經(jīng)過至少三輪的DNA復(fù)制(擴(kuò)增)就會得到中間的那段目的基因。

      3.應(yīng)用OverlapPCR技術(shù):如下圖,采用具有互補(bǔ)末端的引物(b與c兩個(gè)引物互補(bǔ)),使PCR的產(chǎn)物形成一段重疊鏈,然后通過重疊部分的延伸,將來源不同的擴(kuò)增片段重疊拼接的技術(shù)。

       


      4.使用OverlapPCR技術(shù)使基因的定點(diǎn)突變。

       

      大概的過程:

      (1)首先在需要突變的位點(diǎn)設(shè)計(jì)一個(gè)突變的引物對,這對引物對于基因來說位于中央位置,如上圖的Fm和Rm,帶紅色標(biāo)記的是替換成別的堿基,比如正常是C可以換成T等方法,當(dāng)然Fm和Rm位于突變區(qū)域的相同位置而且需要反向互補(bǔ),能夠進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對。同時(shí)還應(yīng)設(shè)計(jì)他們對應(yīng)的引物,也就是基因兩端的,像上圖的F和R引物。

      (2)設(shè)計(jì)好上述的引物:第一輪PCR---分別R和Fm,F(xiàn)和Rm為引物對擴(kuò)增(也可以分兩次做PCR),根據(jù)我上面說的PCR的結(jié)論就可以得到左右兩部分的DNA片段,關(guān)鍵會出現(xiàn)相同也就是一樣的一段---突變位點(diǎn)那部分;

      (3)擴(kuò)增完成后的產(chǎn)物同時(shí)為模板進(jìn)行下一輪的PCR,因?yàn)橥蛔兾稽c(diǎn)倆區(qū)域可以堿基互補(bǔ)配對而連接起來,這樣可以將來源不同的擴(kuò)增片段重疊拼接起來,然后引物的作用下延伸,最后在引物R和F擴(kuò)增出大量的突變基因。這樣可能還是有點(diǎn)模糊和疑問。

      4.為此生物頌100的小崔老師專門找到了北京市海淀區(qū)(2018年期中)考過一個(gè)相關(guān)的的題,可以應(yīng)用一下。

      練習(xí).(2018海淀期中,34)蘿卜的蛋白A具有廣泛的抗植物病菌作用,而且對人體沒有影響。我國科學(xué)家欲獲得高效表達(dá)蛋白A的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌作為微生物農(nóng)藥,做了相關(guān)研究。

      (1)研究者用相同的_________酶處理蛋白A基因和pET質(zhì)粒,得到重組質(zhì)粒,再將重組質(zhì)粒置于經(jīng)_________處理的大腸桿菌細(xì)胞懸液中,獲得轉(zhuǎn)基因大腸桿菌。

      (2)檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)入的蛋白A基因在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)效率很低,研究者推測不同生物對密碼子具有不同的偏好,因而設(shè)計(jì)了與蛋白A基因結(jié)合的兩對引物(引物B和C中都替換了一個(gè)堿基),并按圖2方式依次進(jìn)行4次PCR擴(kuò)增,以得到新的蛋白A基因。

       



      ①這是一種定點(diǎn)的_________技術(shù)。

      ②圖2所示的4次PCR應(yīng)該分別如何選擇圖1中所示的引物?請?zhí)顚懸韵卤砀瘢ㄈ暨x用該引物劃“√”,若不選用該引物則劃“×”)。


      引物A

      引物B

      引物C

      引物D

      PCR1





      PCR2





      PCR3





      PCR4





      (3)研究者進(jìn)一步將含有新蛋白A基因的重組質(zhì)粒和_________分別導(dǎo)入大腸桿菌,提取培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì),用_________方法檢測并比較三組受體菌蛋白A的表達(dá)產(chǎn)物,判斷新蛋白A基因表達(dá)效率是否提高。為檢測表達(dá)產(chǎn)物的生物活性,研究者將上述各組表達(dá)產(chǎn)物加入到長滿了植物病菌的培養(yǎng)基上,培養(yǎng)一段時(shí)間后,比較_________的大小,以確定表達(dá)產(chǎn)物的生物活性大小。

      (4)作為微生物農(nóng)藥,使用時(shí)常噴灑蛋白A基因的發(fā)酵產(chǎn)物而不是轉(zhuǎn)蛋白A基因的大腸桿菌,其優(yōu)點(diǎn)是_________。

       本題答案:

      (1)限制酶和DNA連接    CaCl2

      (2)①基因突變

      ②如下表所示。注:正確填寫PCR1、PCR2、PCR3、PCR4的引物組合之一,每填對一個(gè)得1分。共4分。


      引物A

      引物B

      引物C

      引物D

      PCR1

      ×

      ×

      PCR2

      ×

      ×

      PCR3

      ×

      ×

      ×

      ×

      PCR4

      ×

      ×

      (3)含有蛋白A基因的重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒(pET質(zhì)粒)  抗原-抗體雜交   抑菌圈

      (4)對人、畜、農(nóng)作物和自然環(huán)境安全;不會造成基因污染;有效成分純度較高。(答對一點(diǎn)或其他合理答案均可得分)

      通過這道題,你對PCR定點(diǎn)突變的應(yīng)用應(yīng)該有了更深一層的認(rèn)識,如果還是有疑問可以查閱相關(guān)資料或者加我微信18310709058我們一起探討一下。PCR技術(shù)還有很多應(yīng)用:如檢測基因型,分子克隆,基因敲除等,被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、疾病診斷、農(nóng)業(yè)檢測和法醫(yī)調(diào)查等領(lǐng)域。


      備注:小編能力有限,如有不足之處,希望批評指正,信息僅供參考學(xué)習(xí)。


      參考資料:


      1.黃立華,梁山,谷峻等著 ?!斗肿由飳W(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》,科學(xué)出版社。

      2.http://pic.sogou.com/pics?query=pcr%B6%A8%B5%E3%CD%BB%B1%E4%CA%BE%D2%E2%CD%BC&p=40230500&st=255&mode=255&policyType=0;

      3.https://baike.sogou.com/v483259.htm?fromTitle=%E5%AE%9A%E7%82%B9%E7%AA%81%E5%8F%98


                                          備注:信息僅供參考學(xué)習(xí),如有不足望批評指正。



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